相差顯微鏡是根據試樣的什么性質進行觀察的？
相差顯微鏡的主要缺點是什么？
當載玻片或蓋玻片有厚薄不勻等缺陷時，為什么說對相差顯微鏡觀察的影響比普通顯微鏡大？從傳統上說，合金是指金屬合金，即在一種金屬元素基礎上,加入其他元素,組成具有金屬特性的新材料。所謂高分子合金是由兩種或兩種以上高分子材料構成的復合體系，并非指真正含金屬元素的高分子化合物，而是指不同種類的高聚物,通過物理或化學方法共混,以形成具有所需性能的高分子混合物新材料。在高分子合金中，不同高分子的特性可以得到優化組合，從而顯著改進材料的性能，或賦予材料原不具有的性能。

高分子合金制備簡易，并且隨著組分的改變，可以得到多樣化的物理性能。制備高分子合金的方法主要分化學方法和物理方法兩大類。其中物理方法比較簡單，如溶液共混法，即將兩種以上高分子溶液混合在一起，然后蒸去溶劑即可以得到混合均勻的高分子合金；熔融共混法，即將兩種以上高分子加熱到其熔融溫度以上，采用機械攪拌的方法讓其混合均勻，然后冷卻即得到高分子合金。化學方法主要有共聚、接枝和嵌段等方法；所謂共聚是指在合成過程中引入第二、第三單體，這樣聚合得到主鏈含有不同單體重復單元的聚合物；接枝是指在某一聚合物主鏈上，采用共價鍵聯接的方法將另一種聚合物的鏈段鍵接上去，形成了一種帶支鏈結構的聚合物；嵌段聚合物指兩種以上不同聚合物的線性鏈間有共價鍵相連而形成的含多組分聚合物。表1總結了一些高分子合金的制備方法。
表1高分子合金的制備方法
 

與絕大多數金屬合金都是互容的均相體系不同的是，大多數高分子合金都是互不相容的非均相體系，而組分的相容性從根本上制約著合金的形態結構，是決定材料性能的關鍵。如何改善共混物組分間的相容性，進而進行相態設計和控制，是獲得有實用價值的高性能高分子合金材料的一個重要課題。對合金的織態結構形態、尺寸的研究對制備高性能高分子合金具有重要的意義。高分子合金織態結構的研究方法主要有電子顯微鏡法、光學顯微鏡法、光散射法和中子散射法等。光學顯微鏡法zui為簡單易行和直觀，其中相差顯微鏡(也稱相襯顯微鏡)適合于觀察0.5mm以上的相態結構。
1. 目的要求
了解相差顯微鏡的原理和使用方法。
制備聚苯乙烯（PS）/聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）合金薄膜。
用相差顯微鏡觀察不同配比的PS/PMMA合金薄膜的相結構。
相差顯微鏡原理
2.1相差顯微鏡原理
相差顯微鏡是荷蘭科學家Zermike于1935年發明的，用于觀察未染色標本的顯微鏡。活細胞和未染色的生物標本，因細胞各部細微結構的折射率和厚度的不同，光波通過時，波長和振幅并不發生變化，僅相位發生變化(振幅差)，這種振幅差人眼無法觀察。而相差顯微鏡通過改變這種相位差，并利用光的衍射和干涉現象，把相差變為振幅差來觀察活細胞和未染色的標本。相差顯微鏡和普通顯微鏡的區別是:用環狀光闌代替可變光闌，用帶相板的物鏡代替普通物鏡，并帶有一個合軸用的望遠鏡。
普通的顯微觀察是根據物體對光線的不同吸收來區別的，即圖像的反差是由光的吸收差異產生的。對于單色光的場合，樣品各個結構部分由于對光線吸收大小不同而顯示出不同的亮度，也就是振幅的差別；在采用白光照明的場合則還會由于對不同光譜吸收的不同而改變光譜成份，從而顯示出不同的顏色。這種能引起光線振幅變化的物體稱為振幅物體。另有一類物體，它們是*透明的，而由于不同折射率的結構組成。由于不吸收光線，不能產生明暗或色彩反差，其結構不能被普通顯微鏡識別，但由于物體中不同結構部分具有不同的折射率，使光線通過物體后產生一定的相位差，這類物體稱為相位物體。表2比較了振幅物體與相位物體間的區別和觀察方法。
表2 振幅物體與相位物體

當光線穿過一折射率為ｎ，厚度為d的物體時，光程長度為nd，其物理意義是光線穿過這一物體所需的時間。圖1中a表示同一種物質，其折射率為n，但不同地方物質的厚度不一樣，物體在M0處有一深度為d的微小凹口。此時通過物體其他地方與通過凹口處的光線的光程差為Δ，Δ=(n-1)d。圖1中b為另一種情況，試樣的厚度相同為d，但不同的地方又不同的物質組成，其折射率不同，某部分的折射率為n¢，周圍部分的折射率為n，其中光程差為Δ=(n¢-n)d。但是，光程差不能被眼睛所識別，也不能在照相材料上形成反差。相差顯微鏡的基本原理是，把透過樣品的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結構間的對比度，使各種結構變得清晰可見。光線透過樣品后發生折射，偏離了原來的光路，同時被延遲了1/4波長，如果再增加或減少1/4波長，則光程差變為1/2波長，兩束光合軸后干涉加強，振幅增大或減下，提高反差。
圖1  相位物體 (a)厚度不同，折光指數相同；（b）厚度相同，折光指數不同。
相差顯微鏡（圖2）將光程差變為振幅差的工作是由一個相環和相板完成的，它們可以將直接通過物體的直接光和衍射光區分開來，并進行干涉成像。環形光闌（相環） 位于光源與聚光器之間，作用是使透過聚光器的光線形成空心光錐，焦聚到樣品上。相板在物鏡中加了涂有氟化鎂的相板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4波長，從而使像的反差(對比度)大幅度增強。帶有相板的物鏡稱為相差物鏡。當光學系統性能良好時，人眼能分率的zui小反差約為0.02。
一般的相差聚光器上都裝有數個環狀光闌可以方便地進行轉換，而相板是裝在物鏡中的，因此環狀光闌必須與物鏡匹配，即在使用時應選擇與物鏡上號碼相同的環狀光闌。
環狀光闌的像必須與相板共軛面*吻合，才能實現對直射光和衍射光的特殊處理。否則應被吸收的直射光被泄掉，而不該吸收的衍射光反被吸收，應推遲的相位有的不能被推遲，這樣就不能達到相差鏡檢的效果。相差顯微鏡配備有一個合軸調節望遠鏡，用于合軸調節。使用時撥去一側目鏡，插入合軸調節望遠鏡，旋轉合軸調節望遠鏡的焦點，便能清楚看到一明一暗兩個圓環。再轉動聚光器上的環狀光闌的兩個調節鈕，使明亮的環狀光闌圓環與暗的相板上共軛面暗環*重疊，如圖3所示。調好后取下望遠鏡，換上目鏡即可進行鏡檢觀察。
另外，由于使用的光源為白光，常引起相位的變化，為了獲得良好的相差效果，相差顯微鏡要求使用波長范圍比較窄的單色光，通常是用綠色濾光片來調整光源的波長。
圖3   相板和環狀光闌的調節 （a）相板的暗環，(b)環狀光闌未調中，(c) 環狀光闌與相板成為同心圓
2.2    相差顯微鏡使用中的幾個問題
1) 視場光闌與聚光器的孔徑光闌必須全部開大，而且光源要強。因環狀光闌遮掉大部分光，物鏡相板上共軛面又吸收大部分光。
2) 暈輪和漸暗效應    在相差顯微鏡成像過程中，某一結構由于相位的延遲而變暗時，并不是光的損失，而是光在象平面上重新分配的結果。因此在黑暗區域明顯消失的光會在較暗物體的周圍出現一個明亮的暈輪，這是相差顯微鏡的缺點，它妨礙了精細結構的觀察。當環狀光闌很窄時暈輪現象更為嚴重。相差顯微鏡的另一個現象是漸暗效應或稱為作用帶，它是指相差觀察相位延遲相同的較大區域時，該區域邊緣會出現反差下降。
3) 樣品厚度一般以5—10μm為宜，否則會引起其他光學現象，影響成像質量。當采用較厚的樣品時，樣品的上層是清楚的，深層則會模糊不清并且會產生相位移干擾及光的散射干擾。
4) 載玻片、蓋玻片的厚度應遵循標準，不能過薄或過厚。  當有劃痕、厚薄不勻或凹凸不平時會產生亮環歪斜及相位干擾。玻片過厚或過薄時會使環狀光闌亮環變大或變小。
2.4相差顯微鏡在高分子科學中的應用
幾乎所有的高分子材料都是無色透明的，在普通顯微鏡中不能形成反差。由于高分子合金中不同組分折光指數不同，因此可以采用相差相微鏡進行觀察，其適用的折射率差值一般在0.002～0.004以上。大多數實際的共混高聚物的織態結構要更復雜些，通常也沒有這樣規則，可能出現各種過渡形態，或者幾種形式同時存在。特別對于一個組分能結晶、或者兩個組分都能結晶的共混高聚物，則其聚集態結構中又增加了晶相和非晶相的織態結構，變得更為復雜。由于當光線透過結晶聚合物試樣時在晶相和非晶相之間也存在相位差，可以用相差顯微鏡進行觀察。
儀器與試樣
儀器：  XSZ-H7相差生物顯微鏡，真空烘箱，25ml容量瓶2個，10ml容量瓶5個，載玻片，蓋玻片。
試樣：  聚苯乙烯，聚甲基丙烯酸甲酯，甲苯。
其中一臺相差顯微鏡配有CCD照相機，與電腦聯機，可以記錄合金薄膜的織態結構。
實驗
制樣
1) 采用溶液共混的方法制備一系列聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯的混合甲苯溶液：  
首先將12.5mg的聚苯乙烯和12.5mg聚甲基丙烯酸甲酯分別溶于25ml的甲苯溶液中得到濃度為0.5mg/ml的聚苯乙烯甲苯溶液和聚甲基丙烯酸甲酯甲苯溶液；按PS：PMMA＝1：9、PS：PMMA＝3：7、PS：PMMA＝5：5、PS：PMMA＝7：3、PS：PMMA＝9：1于10 ml容量瓶內配制聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯的混合甲苯溶液。例如：分別吸取1ml 0.5mg/ml的聚苯乙烯甲苯溶液和9ml 0.5mg/ml的聚甲基丙烯酸甲酯甲苯溶液放入10ml 的容量瓶中混合均勻。
2) 制備合金薄膜樣片：
A. 用滴管吸取上述混合溶液滴幾滴于干凈的載玻片上，鋪展開來，讓甲苯溶液自然揮發*，再置于真空烘箱中干燥1小時。
B. 用滴管吸取上述混合溶液滴幾滴于干凈的載玻片上，鋪展開來，蓋上蓋玻片，置于真空烘箱中于120°C退火處理2小時。
3.2 顯微觀察
（1）接通相差顯微鏡電源，把光源亮度調整到合適的強度
（2）把待觀察的載玻片樣品放到載物臺上，選擇10倍數的物鏡，并選用與物鏡配套的環狀光闌，將物鏡調到較接近于試樣。
（3）取出一個目鏡，插入合軸望遠鏡，調節望遠鏡聚焦螺旋使能清楚觀察到物鏡相板與環狀形光闌的像，將環狀光闌調整到與相板同心(如圖3)。取下對合軸望遠鏡，換上顯微鏡目鏡。
（4）聚集觀察，調節顯微鏡載物臺的上下調節鈕，先粗調（眼睛從側面看著物鏡端部，注意不要讓物鏡碰到樣品），再細調到能清晰的觀察到樣品。可利用工作臺縱向、橫向移動手輪來移動樣品，觀察不同區域的分相情況。
（5）觀察、對比不同配比的樣品在相態結構上的區別。
3.3 照相與記錄
在配有CCD照相機的相差顯微鏡上對不同配比的合金薄膜的織態結構進行照相和記錄。
數據處理
對不同PS/PMMA樣品的相態結構進行描述，并指出分散相的尺寸。比較樣品制備方法A和B所得樣品的分相情況和相形態。
常見的奧林巴斯相差顯微鏡型號奧林巴斯CX41，奧林巴斯BX43，奧林巴斯BX53，奧林巴斯倒置顯微鏡CKX31，奧林巴斯倒置顯微鏡CKX41，歡迎用戶。